تعیین برخی ویژگی های کاتالیتیکی و آنالیز مولکولی ژن آنزیم اندو-بتا-1و4-گلوکاناز سویه Bacillus subtilis A14h جدا شده از مزارع برنج

نوع مقاله: علمی پژوهشی

نویسندگان

1 دانش‌آموخته کارشناسی‌ارشد٬ گروه آموزشی کشاورزی، دانشکده کشاورزی دانشگاه آزاد اسلامی واحد سبزوار

2 رییس بخش تحقیقاتی بیوتکنولوژی میکروبی و ایمنی زیستی- پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی ایران، کرج، ایران

3 مربی پژوهشی بخش بیوتکنولوژی میکروبی و ایمنی زیستی، پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی ایران، کرج

چکیده

سلولازها با فعالیت همزمان سه آنزیم اندو-بتا-1و4-گلوکاناز، سلوبیوهیدرولاز و بتا-گلکوزیداز می­توانند سلولز را به واحدهای گلوکز تجزیه کنند. در حال حاضر، سلولازها اغلب در صنایع خوراک دام، نساجی، تصفیه پساب، آبجوسازی و تولید سوخت­های زیستی استفاده می‌شوند و تقاضا برای خرید این آنزیم­ها با ویژگی­های کاتالیتیکی خاص رشد فزاینده­ای دارد. در این مطالعه سویه Bacillus subtilis A14h با قابلیت تولید آنزیم سلولاز با استفاده از روش­های بیوشیمیایی و مولکولی (ژن 16SrDNA) شناسایی شد. شرایط بهینه عملکرد آنزیم تولید شده توسط سویه مورد نظر در حضور دو نوع سوبسترا (کربوکسی متیل سلولز و بتا گلوکان) ودر محدوده دمایی C°70-30 و در pH 6/4 ارزیابی شد. همچنین ژن­ اندو-بتا-1و4-گلوکاناز نیز با استفاده از پرایمرهای اختصاصی تکثیر، توالی یابی ونتیجه در پایگاه اطلاعاتی NCBI ثبت شد. آنالیز توالی‌های به دست آمده و رسم درخت فیلوژنی با استفاده از نرم­افزار Vector NTI و Mega.4 انجام شد. نتایج نشان داد که جدایه مورد بررسی متعلق به گونه B. subtilis است. همچنین نتایج آنالیز فیلوژنتیکی و مقایسه توالی آمینو اسیدی ژن اندو-بتا-1و4-گلوکاناز سویه‏ مورد بررسی نشان داد که ناحیه کاتالیتیکی آنزیم مذکور متعلق به خانواده 5 گلیکوزیل ­هیدرولازها بوده و ناحیه غیرکاتالیتیکی آن در خانواده 3CBM قرار گرفته و بیشترین شباهت را به آنزیم سلولاز سویه‌های B. subtilis دارند. هم‌چنین نتایج نشان داد که بیشترین میزان فعالیت آنزیمی در حضور سوبسترای بتاگلوکان و دمای 55 درجه سانتی‌گراد معادل U/ml 1464 تخمین زده شد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Catalytic Characterization and Molecular Analysis Endo1, 4-Beta Glucanase Gene of Bacillus subtilis Strain A14h Isolated from Rice Fields

نویسندگان [English]

  • Somayeh Khosrojerdi 1
  • Maryam Hashemi 2
  • Maryam Mousivand 3
1 Islamic Azad University, Sabzevar Branch, Sabzevar, Iran.
2 Head of Microbial Biotechnology & Biosafety Department Agricultural Biotechnology Research Institute of Iran (ABRII), Karaj. Iran.
3 Microbial Biotechnology and Biosafety Departments. Biotechnology Research Institute of Iran. Karaj, Iran.
چکیده [English]

Cellulases can hydrolysis cellulose into glucose units which act in a synergistic manner of three enzymes endo-beta -1, 4-glucanase, cellobiohydrolase and beta-glucosidase. Nowadays, cellulases are used in various industries including animal feeds, textile, sewage treatment, brewery industries and biofuel production. Demand for cellulolytic enzymes with unique catalytic properties is growing more rapidly than ever before. In this study, Bacillus subtilis A14h with cellulase production potential was identified using biochemical and molecular (16SrDNA gene) methods.The optimum conditions of B. subtilis A14h cellulase activity was evaluated in the presence of two type of substrates (carboxymethyl cellulose and beta-glucan), temperatures range of 30-70°C,and pH 4.6. Also, endo 1, 4-beta glucanase gene amplified using specific primers, sequencing outcome was recorded in the NCBI database. Sequence analysis and construction of phylogenetic trees was performed using vector NTI and Mega.4 softwares.The results showed that the isolate belongs to the Bacillus subtilis species. The phylogenetic analysis and comparison of the amino acid sequence of endo -1, 4-beta glucanase gene showed that the enzyme catalytic region belongs to glycosyl hydrolases family 5 and the non catalytic region was placed in the CBM3 family. The B. subtilis A14h cellulase was most closely related to the cellulase of B.subtilis strains. The results showed that the highest enzyme activity equal to 1464.25 U/ml was obtained in the presence of beta-glucan substrate at 55° C.

کلیدواژه‌ها [English]

  • endo1 4beta glucanase gene
  • B.subtilis
  • 16s rDNA gene
  • Phylogeny
  • catalytic characterization
Aspeborg H, Coutinho PM, Wang Y, Brumer H, Henrissat B (2012) Evolution, substrate specificity and subfamily classification of glycoside hydrolase family 5 (GH5). BMC Evol. Biol. 12:186-171.

Gilkes NR, Henrissat B, Kilburn DG, Miller Jr RC, Warren RA (1991) Domains in microbial beta-1, 4-glycanases: sequence conservation, function, and enzyme families. Microbiol. Rev. 55(2): 303-315.

Hamamoto T, Foong F, Shoseyov O, Doi RH (1992) Analysis of functional domains of endoglucanases from Clostridium cellulovorans by gene cloning, nucleotide sequencing and chimeric protein construction. Mol. Gen. Genet. 231(3):472–479.

Han SJ, Yoo YJ, Kangs HS (1995) Characterization of a Bifunctional Cellulase and Its Structural Gene. The cel gene of Bacillus SP. D04 has exo and endoglucanase activity. J. Biol. Chem. 270(43): 26012-9.

Iqbal HMN, Ahmed I, Zia MA, Irfan M (2011) Purification and characterization of the kinetic parameters of cellulose produced from wheat straw by Trichoderma viride under SSF and its detergent compatibility. Adv. Bioscience Biotechnol. 2:149-156.

Izquierdo JA, Sizova MV, Lynd LR (2010) Diversity of Bacteria and Glycosyl Hydrolase Family 48 Genes in Cellulolytic Consortia Enriched from Thermophilic Biocompost . Appl. Environ. Microbiol. 76(11): 3545–3553.

Kuhad RC, Gupta R, Singh A (2011) Microbial cellulases and their industrial applications. SAGE-Hindawi access to research, Enzyme Research. Review Article. doi: 10.4061/2011/280696.

Kyoung KY, Jeong OH, Hwan KY (2012) Comparison of nucleotide sequences of endo-β-1,4-glucanase genes from Bacillus subtilis strains. Int. J. Biotechnol. Appl. 4:130-133.

Lee YJ, Kim BK, Lee BH, Jo KI, Lee NK, Chung CH, Lee YC, Lee JW (2008) Purification and characterization of cellulase produced by Bacillus amyoliquefaciens DL-3 utilizing rice hull. Bioresource Technol. 99:378–386.

Li W, Zhang WW, Yang MM, Chen YL (2008) Cloning of the Thermostable Cellulase Gene from Newly Isolated Bacillus subtilis and its expression in Escherichia coli. Mol. Biotechnol. 40:195–201.

Linder M, Lindeberg G, Reinikainen T, Teeri TT, Pettersson G (1995) The difference in affinity between two fungal cellose-bindings domainated by a single amino acid substitution. FEBS Lett. 372:96-98.

Lynd LR, Weimer PJ, Van Zy WH, Pretorius IS (2002) Microbial Cellulose Utilization: Fundamentals and Biotechnology. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 66(3): 506–577.

Mousivand M, Hashemi M, Makhdumi MA (2011) Enzyme production for animal and poultry feed by some biofilm forming Bacillus subtilis strains. IV international conference on environmental, industrial and applied microbiology, Spain.

Park JS, Nakamura A, Horinouchi S, Beppu T (1993) Identification of the cellulose-binding domain of a Bacillus subtilis endoglucanase distinct from its catalytic domain. Biosci. Biotechnol. Biochem. 57(2): 260–264.

Rabinovich ML, Melnick MS, Bolobova AV (2002) The structure and mechanism of action of cellulolytic enzymes. Biochem. 67(8): 850-871.

Robson LM, Chambliss GH (1987) Endo-beta-1,4-glucanase gene of Bacillus subtilis DLG. J Bacteriol. 169(5): 2017–2025.

Sadhu S, Maiti TK (2013) Cellulase Production by Bacteria: A Review. Brit. Microbiol. Res. J. 3(3):235-258.

Shimon LJW, Pagès S, Belaich A, Belaich JP, Lamed R, Shoham Y, Frolow F (2000) Structure of a family IIIa scaffolding CBD from the Cellulosome of Clostridium cellulolyticum at 2.2 A resolution. Acta Cryst. 56: 1560-1568.

Zakaria MR, Tabatabaei M, Mohamad Ghazali F, Abd-Aziz S, Shirai Y, Hassan MA (2010) Polyhydroxyalkanoate production from anaerobically treated palm oil mill effluent by new bacterial strain Comamonas sp.EB172. World J. Microbiol. Biotechnol. 26: 767-774.