آنالیز عملکرد پیش‌بر مصنوعی SP-DD با استفاده از روش اگرواینجکشن در گیاه توتون

نوع مقاله: علمی پژوهشی

نویسندگان

1 دانش‌آموخته کارشناسی‌ارشد بیوتکنولوژی، دانشگاه پیام نور، تهران

2 استادیار پژوهشکده علوم گیاهی دانشگاه فردوسی مشهد

3 دانشیار گروه بیوتکنولوژی کشاورزی دانشگاه پیام نور، تهران، ایران

چکیده

پیش‌برهای مصنوعی القاپذیر با بیمارگرها (Synthetic pathogen-inducible promoters) جایگزین مناسبی برای پیش‌برهای طبیعی در دست‌ورزی ژنتیکی گیاهان با هدف تولید ارقام مقاوم می‌باشند. یک پیش‌بر القاپذیر با بیمارگر در شرایط ایده‌آل باید تنها در پاسخ به بیمارگرهای هدف فعال شود و ژن مقاومت به بیمارگر را به صورت موضعی و موقتی بیان‌ کند. فقدان این ویژگی‌ها در پیش‌برهای طبیعی، توجه را به سمت طراحی پیش‌برهای مصنوعی معطوف داشته است. در ساختار این پیش‌برها از اجزائی چون عناصر تنظیمی سیس استفاده می‌شود که این امر انعطاف‌پذیری بالایی را در تعیین میزان بیان و نوع القاپذیری یک پیش‌بر مهیا می‌نماید. یکی از متداول‌ترین روشهای آنالیز یک پیش‌بر مصنوعی القاپذیر با بیمارگر، استفاده از روش بیان موقت مبتنی بر اگروباکتریوم می‌باشد. با اعمال تیمارهای زیستی و غیر‌زیستی و مطالعه بیان تراژن، آنالیز عملکرد پیش‌بر در زمان کوتاهی قابل انجام است. در این تحقیق، پیش‌بر مصنوعی SP-DD (متشکل از دو نسخه از عنصر تنظیمی و القایی سیس D Box از منشاء پیش‌بر ژن PR2 گیاه جعفری) در اتصال با ژن گزارشگر بتاگلوکرونیداز اینتروندار طبق روش اگرواینجکشن به برگ‌های گیاه توتون گونه بنتامیانا (Nicotiana benthamiana) منتقل شد و عملکرد آن در واکنش به تیمار سالیسیلیک اسید و تنش‌های محیطی بررسی گردید. نتایج نشان داد پیش‌بر مصنوعی SP-DD در پاسخ به سالیسیلیک اسید، ژن بتاگلوکرونیداز را بیان کرد و میزان بیان با گذشت زمان از ۲ ساعت به ۲۴ ساعت از اعمال تیمار، افزایش نشان داد. همچنین پیش‌بر فوق به تنش‌های گرما و سرما حساسیت اندکی نشان داد ولی تنش اشعه ماوراء بنفش بر القاء آن بی‌اثر بود.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Functional Analysis of SP-DD Synthetic Promoter Using Agroinjection Method in Tobacco Plant

نویسندگان [English]

  • Marjan Bahrabadi 1
  • Farhad Shokouhifar 2
  • Mohammad Ali Ebrahimi 3
1 M.Sc. Biotechnology, Payame Noor University, Tehran, Iran.
2 Assistant Professor of Research Center for Plant Sciences, Mashhad Ferdowsi University
3 Associate Professor, Department of Agricultural Biotechnology, Payame Noor University, Tehran, Iran
چکیده [English]

Synthetic pathogen-inducible promoters are suitable alternatives for native promoters in plant genetic manipulation to the purpose of resistant crop production. An ideal pathogen-inducible promoter would only be activated in response to target pathogens. Furthermore, it should express the transgene locally and temporarily. The absence of these characteristics in native promoters have drawn the attentions toward design and construction of synthetic promoters. Some components like cis-regulatory elements are used in construction of synthetic promoters and this provides high flexibility in determining the expression quantity and the inducibility type. One of the most common methods for a synthetic inducible promoter analysis is using Agrobacterium-mediated transient expression system. With this method, Functional analysis of the promoter can be performed in a short time by application of biotic and abiotic treatments and assaying the transgene expression. In this study, the SP-DD synthetic pathogen inducible promoter (containing of two copies of Box D cis-element derived from parsley PR2 promoter) fused with an intron-containing ß-glucuronidase reporter gene was transferred to tobacco leaves (Nicotiana benthamiana) by agroinjection. The promoter function was evaluated in response to salicylic acid treatment and environmental stresses like heat, cold and UV radiation. The results showed that the SP-DD synthetic promoter induced the ß-glucuronidase gene expression in response to salicylic acid and the expression amount increased over time from 2 hours to 24 hours post applicaion. Besides, the promoter showed slight sensitivity in response to heat and cold stresses but the ultraviolet radiation stress had no effect on the promoter induction.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Synthetic promoter
  • Inducible promoter
  • Promoter analysis
  • Agroinjection
  • ß-glucuronidase reporter gene
Boller T (1995) Chemoperception of microbial signals in plant cells. Annual Review of Plant Biology. 46(1): 189-214.

Cervera M (2004) Histochemical and fluorometric assays for uidA (GUS) gene detection. In Transgenic Plants: Methods and Protocols. Springer. 286: 203-213.

Glazebrook J (2005) Contrasting Mechanisms of Defense Against Biotrophic and Necrotrophic Pathogens. Annual Review of Phytopathology. 43: 205-227.

Grant M, Lamb C (2006) Systemic immunity. Current Opinion in Plant Biology. 9(4): 414-420.

Gurr SJ, Rushton PJ (2005) Engineering plants with increased disease resistance: what are we going to express? Trends in Biotechnology. 23(6): 275-282.

Hammond-Kosack KE, Jones J (1996) Resistance gene-dependent plant defense responses. The Plant Cell. 8(10): 1773.

Heil M, Ton J (2008) Long-distance signalling in plant defence. Trends in Plant Science. 13(6): 264-272.

Kunkel BN, Brooks DM (2002) Cross talk between signaling pathways in pathogen defense. Current Opinion in Plant Biology. 5(4): 325-331.

Lee SC, Kim DS, Kim NH, Hwang BK (2007) Functional analysis of the promoter of the pepper pathogen-induced gene, CAPIP2, during bacterial infection and abiotic stresses. Plant Science. 172(2): 236-245.

Liu W, Mazarei M, Rudis MR, Fethe MH, Stewart CN Jr (2011) Rapid in vivo analysis of synthetic promoters for plant pathogen phytosensing. BMC Biotechnology. 11(1): 108.

McDowell JM, Woffenden BJ (2003) Plant disease resistance genes: recent insights and potential applications. Trends in Biotechnology. 21(4): 178-183.

Pieterse CMJ, van Loon LC (1999) Salicylic acid-independent plant defence pathways. Trends in Plant Science. 4(2): 52-58.

Rushton PJ, Reinstädler A, Lipka V, Lippok B, Somssich IE (2002) Synthetic plant promoters containing defined regulatory elements provide novel insights into pathogen-and wound-induced signaling. The Plant Cell Online. 14(4): 749-762.

Ryals JA, Neuenschwande UH, Willits MG, Molina A, Steiner HY, Hunt MD (1996) Systemic acquired resistance. The Plant Cell. 8(10): 1809.

Shokouhifar F, (2009) Construction and functional analysis of pathogen inducible promoters in canola. Dissertation, National Institute of Genetic Engineering and Biotechnology, Tehran.

Shokouhifar F, Zamani MR, Motallebi M, Mousavi A, Malboobi MA (2010) Construction and functional analysis of a pathogen inducible synthetic promoter in response to some biotic and abiotic stresses in Canola. Iranian Journal of Plant Pathology. 45(3): 49-51.

Shokouhifar F, Zamani MR, Motallebi M, Mousavi A, Malboobi MA (2011) Construction and functional analysis of pathogen-inducible synthetic promoters in Brassica napus. Biologia     Plantarum. 55(4): 689-695.

Shokouhifar F, Mottalebi M, Zamani MR (2014) Construction of pGCGi, an expression vector carries intron containing GUS and analysis using micro-bombardment and agroinjection. Iranian Journal of Plant Biology: 97-110.

Weigel D, Glazebrook J (2005) Transformation of agrobacterium using the freeze-thaw method. CSH Protocols. 2006(7): 1031-1036.

Yang Y, Li R, Qi M (2000) In vivo analysis of plant promoters and transcription factors by agroinfiltration of tobacco leaves. The Plant Journal. 22(6): 543-551.

Yang B, Jiang Y, Rahman MH, Deyholos MK, Kav NN (2009) Identification and expression analysis of WRKY transcription factor genes in canola (Brassica napus L.) in response to fungal pathogens and hormone treatments. BMC Plant Biology. 9(1): 68.

Yeri SB (2009) Functional analysis of synthetic promoters and construction of expression cassettes with xynA. Dissertation, University of Agricultural Sciences, Dharwad.

Yeri SB, Bhat RS, Kuruvinashetti MS (2013) Functional analysis of synthetic promoters containing pathogen-responsive cis-elements. Molecular Plant Breeding. 4(34): 270-276.