فرابیان ژن شبه استریکتوسیدین سینتاز-6 در گیاه Arabidopsis thliana

نوع مقاله: علمی پژوهشی

نویسندگان

1 دانشجوی دکترای بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشکده علوم کشاورزی دانشگاه گیلان، رشت، ایران

2 استادیار گروه بیوتکنولوژی کشاورزی دانشکده علوم کشاورزی دانشگاه گیلان، رشت، ایران

چکیده

استریکتوسیدین سینتاز یک آنزیم کلیدی مسییر بیوسنتز ایندول الکالوئیدهای مونوترپنی می‌باشد. آرابیدوپسیس قادر به تولید ترکیبات آلکالوئیدی نیست اما، ژن‌هایی مشابه استریکتوسیدین سینتاز در آن شناسایی شده است. ژن SSL6 از اعضاء خانواده ژنی شبه استریکتوسیدین سینتاز آرابیدوپسیس می‌باشد که در این تحقیق پاسخ ژن آن به تیمار شوری بصورت کمی بررسی و سپس در گیاه آرابیدوپسیس فرابیان شد. بمنظور تولید موتانت فرابیان ژن SSL6 RNA کل استخراج و رشته اول cDNA با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ژن ساخته شد. کلون سازی ابتدایی در ناقل pJET انجام و متعاقبا به سازه فرابیانی گیاهی (pPZPY:SSL6) منتقل شد. در ترانسفورماسیون آرابیدوپسیس از اگروباکتریوم نژاد GV3101(PMP90) و تکنیک غوطه‌وری گل‌آذین استفاده شد. آنالیز گیاهان تراریخت احتمالی در ابتدا با کشت بذرهای حاصل از گیاهان تلقیح شده بر روی محیط گزینشی حاوی آنتی بیوتیک جنتامایسین و گزینش گیاهچه‌های مقاوم انجام شد. در ادامه گیاهان تراریخت احتمالی در طی واکنش PCR با پرایمرهای اختصاصی ژن SSL6 با تولید الگوهای باندی متفاوت در الکتروفورز در مقایسه با گیاهان وحشی و همچنین پرایمرهای اختصاصی ژن مارکر جنتامایسین جداسازی شدند. میزان افزایش بیان ژن انتقال یافته نسبت به گیاه مادری با واکنش Real-Time PCR بر روی گیاهان نسل T2 انجام و نتایج نشان داد افزایش بیان ژن SSL6 در گیاهان تراریخته به طور قابل ملاحظه‌ای بالاتر از گیاه مادری بوده است. تعدادی لاین تراریخت حاوی یک نسخه تراژن از طریق تفرق صفت مقاومت به آنتی‌بیوتیک جنتامایسین در محیط کشت انتخابی در نسل T2 و T3 انتخاب شدند. بررسی کمی بیان ژن SSL6 در گیاهان وحشی Col-0 نیز نشان داد که تنش شوری موجب افزایش معنی‌دار بیان ژن، شش ساعت پس از اعمال تیمار شد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Overexpression of Strictosidine Synthase Like-6 Gene in Arabidopsis thaliana

نویسندگان [English]

  • Amin Abedi 1
  • Mohammad Mehdi Sohani 2
  • Reza Shirzadian 2
1 Ph.D Student, Department of Agricultural Biotechnology, Faculty of Agricultural Sciences, University of Guilan, Rasht, Iran.
2 Assistant Professor, Department of Agricultural Biotechnology, Faculty of Agricultural Science, University of Guilan, Rasht, Iran.
چکیده [English]

The monoterpenoids comprise a family of structurally and pharmaceutically diverse alkaloids. Strictosidine synthase is a key enzyme in monoterpenoid indole alkaloid biosynthesis pathway. In spite of the apparent lack of complex alkaloids in Arabidopsis, a gene family called Strictosidine synthase like (SSL) has been found in the genome. SSL6, a member of SSL family, has been induced significantly by various stresses and signaling molecules. An overexpressed mutant is a powerful tool for functional characterization of an unknown gene. In view of that, SSL6 overexpressed mutant have been generated in order to study the possible role of the gene in Arabidopsis defense against biotic and abiotic stresses. The open reading frame from SSL6 was amplified and cloned into intermediate pJET vector before subcloning into pPZPY122 plant vector. Plant transformation was made by floral dip method using Agrobacterium tumefaciens strain GV3101 (PMP90). The putative transgenic plants were isolated on selective MS medium containing gentamycin. Transgene integration was further analyzed by PCR using SSL6 and gentamycin resistance gene specific primers. The transcription level of SSL6 in the T2 plants was measured using q-PCR and indicated an overexpression in transgenic compared to wild type Col-0 plants. Segregation ratio of plants in T2 and T3 generation on selection medium proved that some of the genotypes contain single T-DNA insert. The SSL6 Expression level in response to salt stress was measured in Col-0 and indicated an up-regulation of the gene 3, 6 and 12 hrs after treatment.

کلیدواژه‌ها [English]

  • in planta
  • Floral dip
  • Overexpression
  • real-time PCR
Ayliffe MA, Pryor AJ (2007) Activation tagging in plants-generation of novel, gain- of-function mutations. Aust. J. Agric. Res. 58: 490-597.

Butaye KM, Cammue BP, Delauré SL, De Bolle MF (2005) Approaches to minimize variation of transgene expression in plants. Molecular Breeding. 16(1): 79-91.

Cline J, Brman JC, Hogrefe HH (1996) PCR fidelity of Pfu DNA polymerase and other thermostable DNA polymerases. Nucleic Acids Res. 24(18): 3546-3551.

Dobritsa AA, Nishikawa SI, Preuss D, Wochniak EU, Summer L W, Hammond A, Carson AL, Swanso RJ (2009) LAP3, a novel plant protein required for pollen development, is essential for proper exine formation. Sex Plant Reprod. 22(3): 167-177.

Dutta A, Sen J, Deswal R (2013) New evidences about strictosidine synthase (Str) regulation by salinity, cold stress and nitric oxide in Catharanthus roseus. J. PLANT BIOCHEM. BIOT. 22(1): 124-131.

Fabbri M, Delp G, Schmidt O, Theopold U (2000) Animal and plant members of a gene family with similarity to alkaloid-synthesizing enzymes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 271: 191-196.

Facchini PJ, Bird DA, St-Pierre B (2004) Can Arabidopsis make complex alkaloids?. Trends Plant Sci. 9(3): 116-122.

Ghedira R, Buck SD, Nolf  JN, Depicker A (2013) The Efficiency of Arabidopsis thaliana Floral Dip Transformation Is Determined Not Only by the Agrobacterium Strain Used but Also by the Physiology and the Ecotype of the Dipped Plant. Mol. Plant Microbe Interact. 26(7): 823-832.

Gynheung A, Jeong DH, Jung KH, Lee S (2005) Reverse genetic approaches for functional genomics of rice. Plant Mol. Biol. 59: 111-123.

Hajdukiewicz P, Syab Z, Maliga P (1994) The small, versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation Plant Mol. Biol. 25: 989-994.

Kibble NA, Sohani MM, Shirely N, Byrt C, Roessner U, Bacic A, Schmidt O, Schultz CJ (2009) Phylogenetic analysis and functional characterization of strictosidine synthase-like genes in Arabidopsis thaliana. Funct. Plant Biol.  36: 1098-1109.

Livak KJ, Schmittgen TD (2001) Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2−ΔΔCT Method. Methods. 25(4): 402-408.

Odell JT, Nagy F, Chua NH (1985) Identification of DNA sequences required for activity of the cauliflower mosaic virus 35S promoter. nature. 313: 810-812.

Pelaz S, Ditta GS, Baumann E, Wisman E, Yanofsky MF (2000) B and C floral organ identity functions require SEPALLATA MADSbox genes. Nature. 405: 200-203.

Prelich G., 2012, Gene Overexpression: Uses, Mechanisms, and Interpretation, Genetics. 190: 841-854.

Sohani MM, Schenk PM, Schultz CJ, Schmidt O (2009) Phylogenetic and transcriptional analysis of a srictosidine synthase-like gene family in Arabidopsis thaliana reveals involvement in plant defence responses. Plant Biol. 11: 105-117.

Stockigt J, Barleben L, Panjikar S, Loris EA (2008) 3D-structure and function of strictosidine synthase -the key enzyme of monoterpenoid indole alkaloid biosynthesis. Plant Physiol. Biochem. 46: 340-355.

Teshima K, Innan H (2008) Neofunctionalization of Duplicated Genes Under the Pressure of Gene Conversion. Genetics. 178(2): 1385-1398.

The Arabidopsis Genome Initiative (2000) Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana. Nature. 408: 796-815.

Walden R, Fritze K, Hayashi H, Miklashevichs E, Harling H, Schell J (1994) Activation tagging: a means of isolating genes implicated as playing a role in plant growth and development. Plant Mol. Biol. 26: 1521-1528.

Weigel D, Ahn JH, Blazquez MA, Borevitz JO, Christensen SK, Fankhauser C, Ferrandiz C, Kardailsky I, Malancharuvil EJ, Neff MM, Nguyen JT, Sato S, Wang ZY, Xia Y, Dixon RA, Harrison MJ, Lamb CJ, Yanofsky MF, Chory J (2000) Activation tagging in Arabidopsis. Plant Physiol. 122: 1003-1013.

Yoshida S, Ito M, Nishida I, Watanabe A (2001) Isolation and RNA Gel Blot Analysis of Genes that Could Serve as Potential Molecular Markers for Leaf Senescence in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol. 42(2): 170-178.

Zhang J (2003) Evolution by gene duplication: an update. Trends Ecol. Evol. 18(6): 292-298.