افزایش مقاومت به تنش شوری در گیاه آرابیدوپسیس تالیانا با فرابیان ژن فسفواتانول آمین N- متیل‌ترانسفراز اسفناج (Spinacia oleracea, Iranian landrace)

نوع مقاله: علمی پژوهشی

نویسندگان

1 دانشجوی دکتری، بیوتکنولوژی کشاورزی گیاهی، دانشکده علوم کشاورزی دانشگاه گیلان، رشت، ایران

2 دانشیار، گروه بیوتکنولوژی کشاورزی دانشکده علوم کشاورزی دانشگاه گیلان، رشت، ایران

3 استادیار، گروه بیوتکنولوژی کشاورزی دانشکده علوم کشاورزی دانشگاه گیلان، رشت، ایران

چکیده

یکی از مکانسیم‌های مقاومت گیاهان به تنش‌های غیرزیستی تولید محلول سازگار گلایسین بتائین است. کولین پیش‌ساز این متابولیت مهم و همچنین یک ترکیب اصلی در حفظ یکپارچگی و سیگنالینگ غشای سلولی است. در گیاهان مهمترین مرحله تولید کولین را آنزیم سیتوپلاسمی فسفو اتانول آمین N-متیل ترانسفراز (PEAMT; EC 2.1.1.103) کاتالیز می‌کند. در این مطالعه ژن PEAMT از یک رقم محلی گیاه اسفناج (Spinacia oleracea Iranian landrace) با استفاده از پرایمرهای اختصاصی تکثیر و در داخل وکتور کلونینگ (pJET) همسانه سازی شد. به منظور فرابیان ژن PEAMT ، سازه ژنیPBI121GUS-9:PEAMT ساخته و در نهایت به باکتری Agrobacterium سویه GV3101(PMP90) منتقل شد. تراریزش گیاهان با استفاده از روش غوطه‌ورسازی گل آذین انجام و آنالیز اولیه گیاهان تراریخت احتمالی با جوانه‌زنی بذور در محیط انتخابی حاوی آنتی بیوتیک کانامایسین بررسی شد. گیاهچه‌های مقاوم به کانامایسین در سطح مولکولی با استفاده از روش PCR غربالگری و تراریختی گیاهان در سطح رونوشت‌برداری با RT-PCR تایید شد. متعاقباً بررسی‌های فنوتیپی گیاهان تراریخت حاوی ژن PEAMT در شرایط تنش شوری نشان داد که طول ریشه اصلی گیاهان تراریخت از مقدار آن در گیاهان شاهد به طور معنی‌داری طویل‌تر، ریشه‌های فرعی گسترده‌تر و رشد رویشی بهتری داشته‌اند. اندازه‌گیری متابولیت گلایسین‌بتائین و آنزیم پراکسیداز نیز نشان داد که گیاهان تراریخته دارای محتوای گلایسین‌بتائین بیشتر و فعالیت آنزیم پراکسیدازی بالاتری نسبت به گیاهان شاهد داشته‌اند.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Enhance salinity resistance in Arabidopsis thaliana by overexpression of phosphoethanolamine N-methyltransferase gene from spinach (Spinacia oleracea, Iranian landrace)

نویسندگان [English]

  • Somayeh Allahi 1
  • Mohammad Sohani 2
  • Hassan Hasani 3
1 Ph.D. Student, Department of Agricultural Biotechnology, Faculty of Agriculture, Guilan University, Rasht, Iran
2 Associate Professor, Department of Agricultural Biotechnology, Faculty of Agriculture Science, Guilan University, Rasht, Iran
3 Assistant Professor, Department of Agricultural Biotechnology, Faculty of Agriculture Science, Guilan University, Rasht, Iran.
چکیده [English]

One of the plant resistant mechanisms to abiotic stresses is production of a compatible solute named glycine betaine. Choline is the precursor of this important metabolite and it is also essential compound for the structural integrity and signaling of cell membrane. In plants, the most important step of choline production is catalyzed by cytoplasmic phosphoethanolamine N-methyltransferase (PEAMT ; EC 2.1.1.103) enzyme. In this study, PEAMT gene from spinach (Spinacia oleracea Iranian landrace) was amplified using specific primers and cloned into an intermediate cloning vector (pJET). In order to overexpression of PEAMT gene, the construct of PBI121GUS-9:PEAMT was made and finally was transferred to the Agrobacterium tumefaciens GV3101 (PMP90). Floral dip method was used for transformation and initial analysis of putative transgenic plants was tested in selective medium containing kanamycin. Then resistant seedlings at the molecular level were evaluated using PCR and RT-PCR methods. Results confirmed plant transformation in the level of transcription. Subsequently, The phenotypic analysis under salt stress showed that the main root length of transgenic plants was significantly longer than control nontransgenics. In adition, glycinebetaine contents and peroxidase activity were significantly higher in transgenic compare to non-transgenics control plants.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Choline
  • Glycine betaine
  • Floral dip
  • Phosphoethanolamine N-methyltransferase (PEAMT)
Amako K, Chen GX, Asada K (1994) Separate assays specific for ascorbate peroxidase and guaiacol peroxidase and for the chloroplastic and cytosolic isozymes of ascorbate peroxidase in plants. Plant Cell Physiol. 35(3): 497-504.

Bobenchik AM, Augagneur Y, Hao B, Hoch JC, Mamoun CB (2011) Phosphoethanolamine methyltransferases in phosphocholine biosynthesis: functions and potential for antiparasite therapy. FEMS Microbiol Rev. 35(4): 609-619.

Chen TH, Murata N (2011) Glycine betaine protects plants against abiotic stress: mechanisms and biotechnological applications. Plant Cell Environ. 34(1): 1-20.

Cruz-Ramírez A, López-Bucio J, Ramírez-Pimentel G, Zurita-Silva A, Sánchez-Calderon L, Ramírez-Chávez E, González-Ortega E, Herrera-Estrella L (2004) The xipotl mutant of Arabidopsis reveals a critical role for phospholipid metabolism in root system development and epidermal cell integrity. Plant Cell. 16(8): 2020-2034.

Einset J, Connolly EL (2009) Glycine betaine enhances extracellular processes blocking ROS signaling during stress. Plant Signal Behav. 4(3): 197-199.

Esfahani K, Salmanian AH (2013) Designing and construction of new plant expression vectors with more recognition sites of restriction enzymes. 8th National Congress of Biotechnology, Tehran, Iran.

Galvan-Ampudia CS, Testerink C (2011) Salt stress signals shape the plant root. Curr Opin Plant Biol. 14(3): 296-302.

Grieve CM, Grattan SR (1983) Rapid assay for determination of water-soluble quaternary ammonium-compounds. Plant Soil. 70(2): 303-30.

Kaeppler SM, Kaeppler HF, Rhee Y (2000) Epigenetic aspects of somaclonal variation in plants. Plant Mol. Biol. 43(2-3): 179-188.

Kumar S, Dhingra A, Daniell H (2004) Plastid-expressed betaine aldehyde dehydrogenase gene in carrot cultured cells, roots, and leaves confers enhanced salt tolerance. Plant Physiol. 136(1): 2843-2854.

Li F, Guo S, Zhao Y, Chen D, Chong K, Xu Y (2010) Overexpression of a homopeptide repeat-containing bHLH protein gene (OrbHLH001) from Dongxiang Wild Rice confers freezing and salt tolerance in transgenic Arabidopsis. Plant Cell Rep. 29(9): 977-986.

McNeil SD, Nuccio ML, Ziemak MJ, Hanson AD (2001) Enhanced synthesis of choline and glycine betaine in transgenic tobacco plants that overexpress phosphoethanolamine N-methyltransferase. Proc. Natl. Acad Sci. USA. 98(17): 10001-10005.

Mou Z, Wang X, Fu Z, Dai Y, Han C, Ouyang J, Bao F, Hu Y, Li J (2002) Silencing of phosphoethanolamine N-methyltransferase results in temperature-sensitive male sterility and salt hypersensitivity in Arabidopsis. Plant Cell. 14(9): 2031-2043.

Nuccio ML, Ziemak MJ, Henry SA, Weretilnyk EA, Hanson AD (2000) cDNA Cloning of Phosphoethanolamine N-Methyltransferase from Spinach by Complementation in Schizosaccharomyces pombe and Characterization of the Recombinant Enzyme. J. Biol. Chem. 275(19): 14095-14101.

Rhodes D, Hanson A (1993) Quaternary ammonium and tertiary sulfonium compounds in higher plants. Annu. Rev. Plant Biol. 44(1): 357-384.

Sakamoto A, Valverde R, Chen TH, Murata N (2000) Transformation of Arabidopsis with the codA gene for choline oxidase enhances freezing tolerance of plants. Plant J. 22(5): 449-453.

Sakr M, El-Sarkassy NM, Fuller MP (2012). Osmoregulators proline and glycine betaine counteract salinity stress in canola. . Agron. Sustain. Dev. 32(3): 747-754.

Smith DD, Summers PS, Weretilnyk EA (2000) Phosphocholine synthesis in spinach: Characterization of phosphoethanolamine N-methyltransferase. Physiol. Plantarum. 108(3): 286-294.

Su J, Hirji R, Zhang L, He C, Selvaraj G, Wu R (2006) Evaluation of the stress-inducible production of choline oxidase in transgenic rice as a strategy for producing the stressprotectant glycinebetaine. J. Exp. Bot. 57(5): 1129-1135.

Wu S, Yu Z, Wang F, Li W, Ye C, Li J, Tang J, Ding J, Zhao J, Wang B (2007) Cloning, characterization, and transformation of the phosphoethanolamine N-methyltransferase gene (ZmPEAMT1) in maize (Zea mays L.). Mol. Biotechnol. 36(2): 102-112.

Ye C, Ye C,  Wu S, Ye C, Wu S, Yang Q, Ye C,  Wu S, Yang Q, Ma C, Yang G,  Wang B (2005) Cloning, sequencing and salt induced expression of PEAMT and BADH in oilseed rape (Brassica napus). DNA Seq. 16(5): 364-371.

Zeisel SH (2006) Choline: critical role during fetal development and dietary requirements in adults. Ann. Rev. Nutr. 26: 229-250.

Zhang H, Murzello C, Sun Y, Kim MS, Xie X, Jeter RM, Zak JC, Dowd SE, Paré PW (2010) Choline and osmotic-stress tolerance induced in Arabidopsis by the soil microbe Bacillus subtilis (GB03). Mol. Plant Microbe. Interact. 23(8): 1097-1104.

Zhang J (2003) Evolution by gene duplication: an update. Trends Ecol. Evol. 18(6): 292-298.

Zhang J, Tan W, Yang XH,  Zhang HX (2008) Plastidexpressed choline monooxygenase gene improved salt and drought tolerance through accumulation of glycine betaine in tobacco. Plant Cell Rep. 27(6): 1113-1124.

Zhang X, Henriques R, Lin SS, Niu QW, Chua NH (2006) Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nat. Protoc. 1(2): 641-646.

Zhou S, Chen X, Zhang X, Li Y (2008) Improved salt tolerance in tobacco plants by co-transformation of a betaine synthesis gene BADH and a vacuolar Na+/H+ antiporter gene SeNHX1. Biotechnol. Lett. 3(2) 369- 376.