نوع مقاله : علمی پژوهشی
نویسندگان
1 استادیار دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی دانشگاه اردکان، اردکان، ایران (دانشجوی سابق دکتری بیماری شناسی گیاهی دانشکده کشاورزی دانشگاه تربیت مدرس)
2 استادیار پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران، ایران،
3 استاد بخش بیماری شناسی گیاهی دانشکدۀ کشاورزی دانشگاه تربیت مدرس،تهران، ایران
4 دانشیار بخش بیماریشناسی گیاهی دانشکدۀ کشاورزی دانشگاه تربیت مدرس،تهران، ایران
5 استادیار پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران، ایران
چکیده
بهطور کلی ژنهای مرجع در تجزیه و تحلیلهای بیان ژن، از بین ژنهای خانهدار انتخاب میشوند، اما تغییرات دیده شده در مقدار بیان مانع اساسی برای استفاده بهینه از آنهاست. از آنجا که بیان هیچ تک ژنی در شرایط مختلف و سلولهای متفاوت ثابت نیست، معرفی و اعتبارسنجی ژنهای مرجع بسیار مهم است. در این تحقیق مناسب بودن هفت ژن خانهدار گندم برای نرمالسازی بیان mRNA در برگ این گیاه در هنگام آلودگی به قارچ Mycosphaerella graminicola مطالعه شده است. به این منظور بیان ژنهای رمزکنندۀ اکتین، روبیسکو، گلیسرآلدهید 3- فسفات دهیدروژناز ، فاکتور طویلسازی ترجمۀ 1 آلفا (TEF 1α)، آلفا-توبولین، فاکتورهای آزادکنندۀ یوکاریوتی 1 و 3 (ERF1 و ERF3) در طول آلودگی توسط روش نوردن بلات معکوس اندازه گیری، و توسط نرم افزارهای اکسل و SAS از لحاظ آماری بررسی شد. بیان ژنهای آلفا-توبولین، TEF 1α و اکتین از بیشترین پایداری برخوردار بود و ژنهای روبیسکو و گلیسرآلدهید 3- فسفات دهیدروژناز کمترین ثبات بیان را داشتند. مطالعه مقایسهای تغییرات در بیان ژنهای مختلف خانهدار گندم در پاتوسیستم گندم - M. graminicola انتخاب ژنهای مرجع را برای روش لکهگذاری نوردنبلات معکوس تسهیل میکند.
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
Evolution of housekeeping Genes for Gene Expression in Wheat Leaves Infected by Mycosphaerella graminicola with Reverse northern dot blot
نویسندگان [English]
- Jalal Gholamnezhad 1
- Forogh Sanjarian 2
- Ebrahim Mohammadi Goltapeh 3
- Naser Safaei 4
- Khadijeh Razavi 5
1 Assistant Professor Faculty of agriculture and natural resources, Ardakan University (Former Graduate Ph.D Student of Department of Plant pathology, Tarbiat Modarres University)
2 Assistant Professor, Agriculture Biotechnology Institute, National Institute of Genetic Engineering and Biotechnology, Tehran, Iran
3 Professor, Department of Plant Pathology, Tarbiat Modarres University, Tehran, Iran
4 Associate Professor, Department of Plant Pathology, Tarbiat Modarres University, Tehran, Iran
5 Assistant Professor, Agriculture Biotechnology Institute, National Institute of Genetic Engineering and Biotechnology, Tehran, Iran
چکیده [English]
As a rule the reference genes used in gene expression analysis have been selected for their housekeeping roles, but the variation observed in most of them is a major obstacle to their effective use. It is widely supported to identify and validate stable reference genes, since no single biological gene is stably expressed between cell types or within cells under different conditions. In this study, suitability of seven wheat housekeeping genes for normalization of mRNA expression in wheat leaves infected by Mycosphaerella graminicola was investigated. Expression level of Actin, Rubisco, Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), Translation Elongation Factor 1α (TEF-1α), α-Tubollin, eukaryotic release factors 1 and 3 (ERF1 and ERF3) genes were examined by reverse northern dot blot method. Expression stabilities of the reference genes were statistically analyzed by Ecxel and SAS softwares. α-Tubolin, TEF-1α and Actin were the three most stable genes whereas the expression of Rubisco and GAPDH had the least stability. The presented comprehensive data on changes in expression of various wheat housekeeping genes in wheat- M. graminicola phatosystem facilitate selection of reference genes for Reverse northern dot blot method.
کلیدواژهها [English]
- Gene expression analysis
- Reference genes
- wheat- M. graminicola
- Reverse northern dot blot
مقدمه
از میان روشهای مختلفی که برای بررسی پروفایل بیانی ژنها وجود دارد، PCR کمی زمان واقعی (Real-time PCR)، درشت آرایه (Macroarray) و ریزآرایه (Microarray) از روشهایی هستند که بهصورت گسترده در این زمینه مورد استفاه قرار میگیرد و این روشها نقش بسیار مهمی را در تحقیقات زیست شناسی دارد (Kavaousi et al., 2009). در مورد Real-time PCR شاخصهایی وجود دارد که لازم است در حین انجام PCR مورد توجه و کنترل قرار گیرند. این شاخصها شامل موارد مقدار اولیه نمونهها، غلظت RNA موجود در نمونه، کارایی ساخت cDNA، و تفاوتها در فعالیت نسخهبرداریهای کلی در بافتها و سلولهای مورد تجزیه و تحلیل است (Chen et al., 2006). در مورد هر سه روش ذکر شده، برای بهدست آوردن نتایج دقیق باید سطوح بیانی ژنهای هدف بهوسیلۀ ژنهای کنترل داخلی، که تحت شرایط مختلف بیان ثابتی دارند و به اصطلاح ژنهای خانهدار یا Housekeeping نامیده میشوند، نرمال سازی گردند. ژنهای کنترل داخلی باید سطح بیان پایداری در بافتهای مختلف تحت تیمارهای متفاوت داشته باشند (Frericks and Esser, 2008). در طول دهههای اخیر ژنهای بتا- اکتین، گلیسرآلدهید 3- فسفات دهیدروژناز (GAPDH)، S18 و S26 RNA ریبوزومی، یوبیکوییتین C، آلفا-توبولین، فاکتور رونویسی 1 آلفا و پروتئین باند شونده به TATA باکس بهعنوان ژنهای کنترل داخلی مناسب برای فرایند Real time PCR و همچنین ریزآرایه ارزیابی شدهاند (Mitter et al., 2009). پیداکردن ژنهای کنترل داخلی عمومی برای نرمالسازی در تمامی نمونههای مورد مطالعه کاری غیرممکن است. دلیل این امر این است که ممکن است سطوح بیانی ژنهای کنترل داخلی در بافت خاصی ثابت باشد و در بافتهای دیگر اینطور نباشد (Bustin, 2002; Bas et al., 2004; Glare et al., 2002).
برای مثال، ژن GAPDH بهعنوان یک ژن مأخد قابل اطمینان در سلولهای غیر کشنده سرطان ریه عمل میکند، در حالیکه ژن hypoxanthine phosphoribosyl-transferase (HPRT) دارای بیان با ثباتی در کبد است (Chen et al., 2006). مناسب بودن ژنهای کنترل داخلی جهت نرمالسازی بهوسیلۀ نرمافزارهای الگوریتمی مانند geNorm، NormFinder، Bestkeeper و General Pattern Recognition انجام میگیرد. سپس، ژنهایی که در ردهبندی دارای بالاترین امتیاز باشند قبل از انجام Real time PCR انتخاب میشوند. گندم یکی از مهمترین محصولات کشاورزی در جهان است که در رژیم غذایی اکثر مردم قرار دارد (Curtis et al., 2002). گیاه گندم در طول دورۀ رشد در معرض تنشهای محیطی زنده و غیر زنده مختلفی مانند بیماریها و خشکی قرار میگیرد که رشد گیاه را محدود میکنند (Bohnert et al., 1995). یکی از بیماریهایی که به گندم در زمان کشت خسارت زیادی در اکثر نقاط دنیا وارد میکند بیماری سوختگی برگ گندم میباشد (Goodwin et al., 2003). عامل این بیماری قارچ بیمارگر Mycosphaerella graminicola (Fuckel) J.Schröt.in Cohen با شکل غیرجنسی Zymoseptoria tritici است (Quaedvlieg et al., 2011). راههای مبارزه با این بیماری متعدد هستند که از آن جمله میتوان بهروشهای مبارزه زراعی، شیمیایی و استفاده از ارقام مقاوم اشاره نمود؛ با توجه به عدم کارایی روشهای مبارزۀ زراعی و شیمیایی در کنترل بیماری استفاده از ارقام مقاوم اقتصادیترین، بهترین و از نظر زیستمحیطی، سالمترین روش مقابله با این بیماری است (Eayle, 1999). دانش ژنتیک مقاومت برای اصلاح گندم مقاوم به بیماری لکه برگی گندم از اهمیت زیادی برخوردار است. مقاومت ژنتیکی در ارقام مختلف بهدو صورت کمی و کیفی گزارش شده است (Mccartney et al., 2003). ژنهای متعددی در پاسخ گیاه به بیمارگر فعال یا خاموش میشوند و همچنین ممکن است بیان آنها افزایش یا کاهش پیدا کند. بررسی بیان متمایز ژنها یکی از روشهای مهم برای مشخص نمودن اساس زیستی سیستمهای بیولوژیک است (Wang et al., 2009). جهت درک مکانیسم مقاومت به بیماری سوختگی برگ گندم، لازم است که الگوی بیانی ژنها جهت یافتن مسیرهای حیاتی مورد بررسی قرار بگیرند، در نتیجه برای این مطالعات نیاز به ژنهای خانهداری است که بیان ثابتی را در گندم و بهخصوص در این پاتوسیستم داشته باشند (Tenea et al., 2011). در این مطالعه، تعداد هفت ژن منتخب خانهدار برای این پاتوسیستم انتخاب شدند و ثبات بیان آنها در گندم زمانی که برگهای آن بهوسیلۀ بیمارگر M. graminicola تلقیح شدند با استفاده از روش Reverse northern blot بررسی شد. در نهایت انحراف معیار بیان هر یک از ژنها، که با استفاده از این روش بهدست آمدند، با استفاده از نرم افزارهای Excel محاسبه و با نرمافزار SAS مورد مقایسه قرار گرفت. این هفت ژن کنترل داخلی بر اساس ثبات در میزان بیان ژن، که با استفاده از این روش کمی مورد ردیابی قرار گرفتند، ردهبندی شدند.
مواد و روشها
کشت گیاهان و ایجاد تنش بیمارگر
رقم گندم هگزاپلوئید متحمل زاگرس در این تحقیق مورد استفاده قرار گرفت. برای کشت گیاهان، پس از اینکه خاک گلدانها (محتوی پرلیت، خاک و خاکبرگ) سترون شد، با نسبت 1:1:1 مخلوط و در گلدانهای کوچک 500 گرمی ریخته شدند. بعد از آمادهسازی خاک گلدانها، بذور را در داخل ظرف محتوی الکل 70% بهمدت 30 ثانیه ریخته و سپس الکل را تخلیه و دو بار با آب مقطرسترون، بذرها شسته شدند. بعد از ضدعفونی سطحی، سه بذر در داخل هر گلدان قرارداده شد و روی بذرها به ضخامت یک سانتیمتر از همان خاک ریخته شد. بهمنظور ارزیابی میزان تغییرات بیان ژنهای خانهدار در گندم نسبت به بیمارگر
M. graminicola در شرایط گلخانهای، زمانیکه گیاهچهها به مرحلۀ دو برگی (12روزهگی) رسیدند، سوسپانسیون قارچ بیمارگر بر روی این گیاهان اسپری شد. جهت آمادهسازی سوسپانسیون و پاشش آن بر روی گیاه از روش Chartrain و همکاران در سال 2004 استفاده شد.
بهمنظور تهیه cDNA گیاهان در شرایط بدون تنش و تنش با بیمارگر M. graminicola، در زمانهای 0، 3، 6، 12 و 24 ساعت بعد از مایهزنی بیمارگر، نمونهبرداری از برگهای گیاه گندم انجام گرفت و بلافاصله برگها در محل نمونهبرداری به ظرف نیتروژن مایع منتقل و سپس در فریزر °C70- آزمایشگاه ذخیره شدند. نمونههای شاهد که با آب مقطر مایهزنی شده بودند نیز بههمین ترتیب جمعآوری شدند. این آزمایش در قالب طرح کاملاً تصادفی در سه تکرار انجام گرفت.
انتخاب ژنها و تکثیر آنها
در این تحقیق از هفت ژن منتخب خانهدار شامل اکتین، روبیسکو، گلیسرآلدهید 3- فسفات دهیدروژناز (GAPDH)، Translation Elongation Factor1-α (TEF1α)، آلفا-توبولین، فاکتورهای آزادکنندۀ یوکاریوتی 1 و 3 (ERF1 و ERF3) و همچنین ژن 18S RNA ریبوزومی جهت حذف نمودن اثر پس زمینه (Background) استفاده شد (جدول 1). این ژنها بر اساس مرور منابع، همواره کمترین تغییرات را در مطالعات انجام شده بیان ژنها با روشهای مختلفی از جمله Real-time PCR، داشتهاند (Tenea et al., 2011; Paolacci et al., 2009; Gimenez et al., 2010). آغازگرهای اختصاصی برای هر ژن با استفاده از توالیهای ژنهای مورد نظر توسط نرم افزار Oligo5 طراحی شدند. پس از ساخت آغازگرهای اختصاصی (جدول1) شرایط PCR برای هر یک از جفت آغازگرهای هر ژن بهینه شد. برای انجام PCR از الگوی cDNA استفاده گردید که متعاقباً روش ساخت آن خواهد آمد. واکنش زنجیرهای پلیمراز در شرایط دمایی ºC 95 برای واسرشتسازی ابتدایی بهمدت 4 دقیقه، به دنبال آن 30 چرخه دمای ºC 94 برای 45 ثانیه، دمای چسبیدن بسته دمای ذوب هر آغازگر بهمدت 45 ثانیه و ºC 72 برای 45 ثانیه و در نهایت ºC 72 برای توسعۀ نهایی بهمدت 5 دقیقه انجام شد. پس از پایان واکنش برای مشاهدۀ محصول حاصل، الکتروفورز روی ژل آگارز 5/1% در بافر 1x TAE انجام گرفت و جهت نمایان کردن قطعات DNA در ژل از رنگ آمیزی در ژل از رنگ اتیدیوم بروماید و لامپ UV استفاده شد. مقدار هر ژن از مقایسۀ میزان روشنایی باند محصول PCR با میزان روشنایی باند متناظر Ladder و کمیکردن آن با نرمافزار Totallab مشخص شد. از محصول PCR هر ژن 5/0 تا 1 میکروگرم جهت لکهگذاری بر روی غشا استفاده گردید.
جدول 1. نام ژنها و توالیهای پرایمری مورد استفاده در نوردرن بلات معکوس
Annealing temp. |
Primers (5′ - 3′) |
Candidate reference genes |
58 ºC |
F: GCCACACTGTTCCAATCTATGA |
Actin |
|
R: TGATGGAATTGTATGTCGCTTC |
|
64 ºC |
F: GTGATGGCTTCGTCGGCTACC |
RUBISCO |
|
R: CTTCTTGACCTCCTCCACCTC |
|
64 ºC |
F: TCACTGACAAGGACAAGGCTG |
GAPDH |
|
R: CTGGCTTCGCAAGTCTAACAG |
|
64 ºC |
F: GGTGATGCTGGCATAGTGAAG |
TEF-1α |
|
R: GATGACACCAACAGCCACAG |
|
58 ºC |
F:GCTTTCAACACCTTCTTCAG |
α-Tubulin |
|
R:GGGGCATAGGAGGAAAGCA |
|
56 ºC |
F: ATTCAGTCATCACTTCAGTCG |
ERF1 |
|
R: TCGCTCTTCCTCATTTGTGTC |
|
61 ºC |
F: TGGCGAGGGGCAAGCACTAC |
ERF3 |
|
R: GGAGGAGGAGGACGAGGATG |
|
58 ºC |
F: CTT CGGGATCGGAGTAATGATTAA |
18S rRNA |
|
R: GCCCAGAACATCTAAGGGCATCACAGA |
|
ساخت پروب نشاندار
پس از پودر کردن بافتهای اندامهای هوایی در نیتروژن مایع با استفاده ازهاون چینی، استخراج RNA کل توسط کیت RNXplus شرکت سیناژن مطابق دستورالعمل انجام گرفت. در ابتدای کار، در حدود 5 میکروگرم RNA کل با مقدار 5/0 میکرولیتر آغازگر مخلوط شدند. پس از واسرشت شدن در دمای ºC 65 بهمدت 5 دقیقه و سرد کردن این مخلوط بر روی یخ، واکنش رونویسی معکوس در حضور Thermo Scientific RiboLock RNase و Reverse Transcriptase بهمدت 1 ساعت در دمای ºC 42 انجام گرفت. در مرحلۀ پایانی بهمنظور غیر فعال نمودن آنزیم ویال بهمدت 10 دقیقه در دمای ºC 70 قرار گرفت و سپس به فریزر ºC20- منتقل شد. از RNA استخراجی 5/0 میکرولیتر آغازگر Ologo (dt)18 و در حدود 5 میکروگرم RNA کل با هم مخلوط شدند. پس از واسرشت نمودن در دمای 65 بهمدت 5 مخلوط حاصل بر روی یخ گذاشته شد. به مخلوط حاصل جهت رونوشت برداری معکوس 4 میکرولیتر بافر x5، 1 میکرولیتر ازDIG-dNTP 10 میلیمولار، 5/0 میکرولیتر RiboLock RNase و 1 میکرولیتر Reverse Transcriptase (هر دو از شرکت Thermo Scientific، آلمان) اضافه شد و مخلوط حاصل بهمدت 1 ساعت در دمای ºC 42 قرار داده شد و پروب نشاندار تهیه گردید. برای تکثیر ژنها، جهت لکهگذاری بر روی غشا از cDNA ساخته شده بههمین روش اما با dNTP معمولی، مورد استفاده قرار گرفت. برای تهیه درشت آرایه محصول PCR ژنهای انتخابی با استفاده از محلول NaOH 1 میلیمولار و محلول 25/0 مولار NaCl واسرشت شدند و در دستگاه بلاتر 96 چاهکی بر روی غشاء لکهگذاری شدند. پس از خشک شدن غشاء در دمای اتاق، غشاء حاصل بهمدت یک ساعت در دمای ºC100 قرار داده شد تا مولکولهای cDNA بر روی آن تثبیت شوند. از محصول PCR ژن s 18 RNA ریبوزومی گندم و از آب مقطر بهعنوان کنترل منفی استفاده شد (Zheng et al., 2004).
جهت واسرشت کردن، نشانگرها تهیه شده بهمدت 5 دقیقه در آب جوش و بهدنبال آن 5 دقیقۀ دیگر بر روی یخ قرار داده شدند. پیش دورگهسازی غشا با 50 میلیلیتر از محلول پیش دورگسازی با 2/7 pH= (35 میلیلیتر SDS 7%، 100 میکرولیتر EDTA 1 میلیمولار و 5/12 میلیلیتر بافر فسفات 25/0 مولار) در دمای ºC 65 بهمدت 5/1 ساعت انجام شد. در مرحلۀ بعد 50 میکرولیتر نشانگر واسرشته به 5 میلیلیتر محلول پیش هیبریداسیون اضافه گردید و دورگ سازی بهمدت یک شب در دمای ºC65 انجام شد. بعد از دورگسازی، غشاء سه مرتبه شستشو داده شد. شستشوی اول غشاء با محلول X2 SSC حاوی 1/0 درصد SDS دو مرتبه بهمدت 15 دقیقه در دمای اتاق، شستشوی دوم غشا با محلول X5/0 SSC حاوی 1/0 درصد از SDS یک بار بهمدت 15 دقیقه در دمای °C65 و شستشوی آخر غشاء با محلول X2/0 SSC بدون SDS بهمدت 15 دقیقه در دمای اتاق انجام شد. در مرحلۀ آخر 10 میکرولیتر سوبسترای CDS-Star به غشا اضافه گردید. سپس غشا به تاریک خانه بوده و در معرض فیلم رادیولوژی (X-ray) گذاشته شد و بعد از 30 دقیقه فیلم ظاهر گردید. امتیازدهی به لکهها با استفاده از نرم افزار TotalLab صورت گرفت که میزان تیرگی لکهها را براساس تعداد نقاط تیره موجود در محدوده لکه مورد نظر مشخص میکند. در مرحلۀ آخر پردازش دادههای غشا و قبل از ورود دادهها به نرمافزارهای آماری جهت حذف نمودن اثر پس زمینه (Back ground) همۀ دادهها بر s 18 RNA ریبوزومی تقسیم شدند و سپس دادههای حاصل از نرمافزار TotalLab وارد نرمافزار Excel شدند.
تجزیه و تحلیلهای آماری
سطوح بیانی ژنها، که در واقع تیرگی لکهها است، بهصورت کمی از نرمافزار TotalLab خروجی گرفته میشود. برای محاسبۀ تغییرات بیان ژن در طول زمان دادههای حاصله وارد Excel شدند، برای هر کدام از این 7 ژن، در طول 24 ساعت نمودار خطی (میانگین چهار تکرار) رسم شد و میزان نوسان این ژنها با شاخص انحراف معیار اندازهگیری شد و سپس میانگین انحراف معیار مربوط به هر ژن با استفاده از آزمون چند دامنهای دانکن در سطح اطمینان بهوسیلۀ نرم افزار SAS ver.9 مورد مقایسه قرار گرفت.
نتایج و بحث
هدف اصلی از نرمالسازی بیان ژنها کمکردن اختلاف بین نمونههای آزمایشی است، که این اختلافات ناشی از تفاوت در روش آزمایش، تفاوت در آمادهسازی نمونهها، کیفیت RNA کل، سنتز cDNA و راندمان تکثیر ژنهای هدف میباشد. ژنهایی که برای فرایند نرمالسازی مورد استفاده قرار میگیرند ژنهای مرجع نامیده میشوند و غالباً تغییراتی در سطوح بیانی آنها در طول آزمایش اتفاق نمیافتد (Galiventi et al., 2010). تحقیقات زیادی در مورد معرفی ژن مرجع در گندم جهت استفاده در روش Real time PCR صورت گرفته است، اما تاکنون مطالعات سیستماتیکی در مورد فرایند نرمال سازی ژنها با استفاده از روش نوردرن بلات معکوس انجام نشده است ، مطالعه حاضر اولین تحقیق در مورد ژنهای مرجع با این روش در پاتوسیستم مذکور است. در این مطالعه هفت ژن (جدول1) جهت انتخاب بهترین ژنهای مرجع در پاتوسیستم گندم - M. graminicola مورد بررسی قرار گرفتند. بر اساس اطلاعات بهدست آمده از غشاء (برای مثال شکل 3 لکهها مربوط به ژن اکتین) میزان بیان ژنهای خانهدار در دورۀ 24 ساعت نمونهبرداری بهصورت متفاوتی تغییر پیدا کرد (نمودارهای 1، A-G). مقادیر میزان پایداری بیان ژنهای خانهدار با استفاده مقایسۀ انحراف معیار دادههای مربوط به هر ژن خانهدار در طی زمان 24 ساعت مشخص شد. به این ترتیب که هر چه انحراف معیار کمتر باشد در نتیجه پراکندگی دادهها کمتر و دادهها از پایداری بیشتری در طی زمان نمونهبرداری برخوردار بودهاند. ثبات بیان بالای ژن آلفا-توبولین، نشاندهندۀ آن است که میتوان از آن بهعنوان یک ژن کنترل داخلی مناسب استفاده شود.
B |
A |
D |
C |
F |
E |
G
شکل1. تغییر بیان ژنهای خانهدار در روش نوردرن بلات معکوس. زمان نمونه برداری 0، 3، 6، 12 و 24 ساعت بعد از تلقیح بیمارگر و شاهد تلقیح شده با آب، t: زمان نمونه برداری به ساعت. +NP: تیمار بدون بیمارگر، +P: تیمار با وجود بیمارگر. نمودارها کمیت مربوط به تیرگی ژنها نسبت به لکۀ 18SrRNA در هر بلات را نشان میدهد که با استفاده از نرم افزار TotalLab بهدست آمده است. A: اکتین، B: روبیسکو، C: گلیسرآلدهید 3- فسفات دهیدروژناز، D: TEF 1α، E: آلفاتوبولین، F: فاکتورهای آزادکنندۀ یوکاریوتی1 (ERF1) G: فاکتورهای آزادکنندۀ یوکاریوتی 3 (ERF3)
جهت ارزیابی پایداری در سطوح بیانی این هفت ژن، انحراف معیار سطوح بیانی این ژنها محاسبه شد و سپس با استفاده از نرمافزار آماری SAS 9، مورد مقایسه قرار گرفتند. در شکل 2 انحراف معیار هر یک از این ژنها نشان داده شده است، انحراف معیار کمتر نشاندهندۀ پایداری بیشتر ژن مذکور در طی فرایند آزمایش است.
بر اساس نتایج این مطالعه، ژنهای آلفا-توبولین، TEF-1α و اکتین پایدارترین ژنها جهت استفاده بهعنوان ژنهای کنترل داخلی بودند، و ژن ERF1 چهارمین ژن پایدار در این تحقیق بود. بر اساس نمودار 2 ژن روبیسکو و GAPDH کمترین پایداری را در بین ژنهای بررسی شده در این تحقیق با استفاده از روش نوردرنبلات معکوس داشتند.
شکل 2. انحراف معیار بیان ژنهای خانهدار، مقدار عددی بیشتری نشاندهندۀ پایداری کمتر در بیان ژن است. انحراف معیارهایی که با حروف مختلف نشان داده شدهاند در آزمون دانکن (05/0P≤) دارای اختلاف معنیدار میباشند.
شکل 3. عکس از درشت آرایههای تهیه شده از بیان ژن خانه دار اکتین، 0SA+NP: گیاه گندم تحت تیمار آب مقطر و عدم وجود بیمارگر، 0SA+P: گیاه گندم تحت تیمار آب مقطر و بیمارگر ، 2SA+NP: گیاه گندم تحت تیمار غلظت 2 میلیمولار اسیدسالیسیلیک و عدم وجود بیمارگر، 0SA+P: گیاه گندم تحت تیمار غلظت 2 میلیمولار اسیدسالیسیلیک و بیمارگر؛ نقاط زمانی شامل ساعت 0، 3، 6، 12 و 24 ساعت بعد از نمونهبرداری است.
در مطالعهای که با استفاده از روش Real time PCR انجام گرفت، ثبات بیان ژنهای خانهدار اکتین (Ta54825)، آلفا-توبولین (Ta25534)، بتاتوبولین (Ta44405)، یوبیکوئیتین (Ta50503)، GAPDH (Ta30768)،Translation elongation factor (Ta53964)،Translation initiation factor (Ta54280)، Ribosomal protein (Ta27771) و هیستون (Ta38797) در گندم بررسی شد. نتایج این تحقیق که با استفاده از الگوریتمهای ریاضی geNorm و NormFinder انجام گرفت نشان داد که همگی این ژنها از سطح بیان قابل قبولی در ارقام مختلف گندم برخوردار بودند و میتوانند بهعنوان ژن خانهدار انتخاب شوند (Paolacci et al., 2009). با بررسی سه ژن ACT2 (actin 2)، TaFNRII (ferredoxin-NADP(H) oxidoreductase، و rrn26 ( a putative Homologuse to RNA 26S gene) که بهعنوان ژنهای مرجع شناخته شدهاند و دو ژن دیگر YP18-2 (Cyclophilin A و TaWIN1 (14-3-3 like protein) در گندمهای زمستانه تحت تنش نیترات، ژنهایTaFNRII, ACT2 و CYP18-2 بهعنوان ژنهای مرجع در این سیستم پیشنهاد شدهاند (Tenea et al., 2011). مطالعه جهت تعیین بهترین ژن مرجع در دوره نمو گیاه چای مشخص شد که ژنهای GAPDHو بتا توبولین بدترین انتخابها وژن TATA-box binding protein بهترین انتخاب در این سیستم از میان نه ژن مورد بررسی، هستند (Wu, Z.-J. et al., 2016). گرچه از ژن GAPDH در مطالعات زیادی بهعنوان ژن مرجع استفاده شده است، اما در مطالعه حاضر الگوی بیانی ثابتی را نشان نمیداد. مطالعات دیگری نیز عدم ثبات بیانی این ژن را نشان دادهاند (Wu, Z.-J. et al., 2016; Yang et al., 2016). با توجه به اینگونه مطالعات، تعداد بهینه ژن مرجع برای نرمال سازی در هر پژوهش، دو تا سه ژن است که با توجه بهتعداد نمونهها و روش مورد استفاده، متفاوت خواهد بود. در اغلب مواقع، استفاده از حداکثر سه ژن مرجع حدقابل قبولی از نرمال سازی را به وجود میآورد (Gime´nez et al., 2010). مطالعات زیادی نشان دادند که بیان ژنهای خانهدار در طی ایجاد تنش در شرایط مختلف میتواند بهطور چشمگیری تغییر پیدا کند و در نتیجه تأثیر زیادی هم بر روی نتایج نهایی میگذارد (Bustin, 2000). علاوه بر شاخصهای زیستی، محدودیتهای آزمایشگاهی و عوامل اقتصادی در انتخاب تعداد مطلوب ژنهای کنترل داخلی دخالت دارند (Lopez-Landavery et al., 2014). ریزآرایه و Real time PCR از روشهای مرسوم در کمیسازی بیان ژن هستند (Kavaousi et al., 2009). استفاده از روش ریزآرایه احتیاج به تجهیزات خاص دارد که ممکن است در دسترس همگان نباشد. با روش Real time PCR نیز در هر آزمایش تعداد معدودی ژن را میتوان بررسی کرد. درشت آرایه نیز یکی از ابزارهای قدرتمند بررسی بیان ژن است که امکان بررسی همزمان تعداد قابل توجهی ژن را با تجهیزات معمول آزمایشگاه میدهد (Ji et al, 2003). مطالعه حاضر ژنهای مرجع مناسب برای استفاده در این روش ارایه داده که در برهمکنش گندم و قارچ M. graminicola کارآمد بوده و در مطالعات آتی مورد استفاده قرار خواهند گرفت.
سپاسگزاری
از پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری (طرح 451م) و همچنین دانشگاه تربیت مدرس برای فراهم آوردن امکانات این پژوهش تشکر و قدردانی میگردد.